问：2017年诺贝尔化学奖于10月4日揭晓，Jacques Dubochet, Joachim Frank和Richard Henderson这三位科学家因在开发用于获取溶液中生物分子高分辨率图像的冷冻电子显微镜技术而获奖 。请问什么是冷冻电子显微镜技术，开发这种技术有什么重要性？
答：冷冻电子显微镜（cryo EM）指的是在低温下制备样品并进行观察的透射电子显微镜技术。这种技术之所以重要，是因为它能够帮助我们更方便地研究生物分子的结构，而这对于认识生命现象、开发新的药物等方面的意义都是不言而喻的。
问：那么在冷冻电子显微镜诞生之前，我们有什么方法研究生物的结构，它们有什么局限吗？
答：首先，光学显微镜是我们观察生物体的重要手段，但光学显微镜的分辨率的极限仅仅为可见光波长的一半，即200纳米左右。生物体的许多结构都小于这个尺度，例如很多病毒的直径都只有几十纳米，因此无法用光学显微镜观察。而要想进一步了解生物分子的结构，弄清楚分子中原子之间的排布方式，我们需要观察的尺度小于1纳米，光学显微镜显然更是无能为力。
幸运的是，我们有一个好的帮手，那就是比可见光波长更短的电磁波，例如X射线。X射线的波长在0.01-10纳米这个范围，与晶体中原子之间的距离相当，因此当它穿过晶体时会发生散射。而晶体中的原子呈现周期性的排列，这会导致被散射的X射线发生干涉，从而形成特定的图案。根据这些图案，我们就可以推算出晶体的结构，这就是X射线衍射的基本原理。利用X射线衍射，我们不仅可以测定小分子化合物的晶体结构，还可以了解蛋白质等生物大分子的晶体结构。著名的DNA双螺旋结构就是通过X射线衍射确定下来的。因此，X射线衍射成为了测定生物大分子晶体结构的 “金标准”。
然而X射线衍射的局限也相当明显。首先，样品必须能够形成晶体，其结构才能被测定，然而不少生物大分子很难形成晶体。其次，X射线衍射要想得到满意的结构，通常需要足够量的样品，这对于不少生物大分子来说也是很难办到的。因此，不少研究人员尝试利用电子显微镜来代替X射线衍射。
电子显微镜的基本原理是电子具有波粒二象性，且运动速度越快，波长越短。因此，如果让高速运动的电子穿过样品，通过观察样品不同区域对电子吸收的不同来确定样品结构，我们可以轻而易举地突破光学显微镜的分辨率限制。通常所说的透射电子显微镜就是基于这一原理。理论上，透射电子显微镜可以达到原子尺度的高分辨率，且样品不需要结晶就可以观察。但对于生物样品来说，做到这一点非常困难。
问：那么用透射电子显微镜来观察生物样品存在哪些问题呢？
答：首先，高速运动的电子束很容易破坏生物样品的化学结构，导致我们无法准确观察样品的结构。为了减少电子对生物样品的破坏，我们可以降低照射到样品上的电子束的强度，但这样一来得到的图像的信噪比就会显著下降。为了提高成像质量，在观察生物样品时，我们常常向样品中人为添加一些化学物质，增强样品不同区域的反差，同时降低电子对样品的破坏。即通常所说的染色。染色能够帮助我们更好地观察生物体的结构，但这一方法对于原子尺度的结构信息无能为力。这是因为用于染色的物质常常以微粒的形式进入样品，这些微粒的尺寸远远超过原子间的距离，因此遮盖了样品中更加细微的结构。如何在无需染色的情况下获取生物样品的高分辨率图像显然是科学家们要解决的一大难题。
另外，用透射电子显微镜观察样品时，样品通常需要置于高真空的环境中，否则空气中的气体分子与电子的相互作用会干扰成像。这对于观察生物样品也是一大挑战，因为生物分子通常要在水溶液中才能正常发挥作用。在通过透射电子显微镜观察生物样品的过程中，随着水分的挥发，生物体的结构往往会发生变化。因此，即便我们能得到高质量的图像，从中获得的信息往往也并不能反映真实的生理过程。
正是因为这些局限，很长一段时间以来，透射电子显微镜被认为只能观察死的生物体，且分辨率有限。幸运的是，在包括今诺贝尔化学奖三位得主在内的一大批研究人员的不懈努力下，用透射电子显微镜获取生物分子的高分辨率图像这一梦想正在成为现实，这就是如今我们看到的冷冻电子显微镜技术。
问：那么获得今年诺贝尔化学奖得主的三位科学家为冷冻电子显微镜的发展做出了哪些贡献呢？
答：研究人员很早就意识到，如果将生物样品置于极低的温度下用透射电子显微镜进行观察，不仅电子束对样品的损害大为降低，而且由于在低温下水冻结成冰，在真空下挥发速度减缓，这样一来，我们观察到的图像就更加接近样品真实的环境。但随之而来的一个问题是，那就是水的晶体会干扰入射的电子束，使得得到的电子显微镜图像不能反映样品的真实结构。
在上世纪80年代，Jacques Dubochet找到了解决这个问题的办法，那就是将水快速降至极低的温度，结果水分子来不及形成晶体。这样的结构与玻璃有相似之处，因此也被称为“玻璃态水”(vitrified water) 或者“无定形冰”(amorphous ice). 这一技术的发明解决了水的结晶对于透射电子显微镜成像的干扰，从而为获取生物样品的高分辨率图像奠定了基础。
但有了合适的低温样品制备技术还不够，因为我们通过透射电子显微镜得到的只是样品的二维图像，且信噪比可能仍然不够理想。为了解决这一问题，Richard Henderson选择了一种结构特殊的蛋白质为研究对象，通过从不同角度获取蛋白质的图像并加以后处理，Henderson在1990年首次利用冷冻电子显微镜获得了分辨率与X射线晶体相当的蛋白质三维图像，从而证明了这一技术的潜力。而Joachim Frank则开发出一种图像处理方法，能够将低分辨率的二维电子显微镜图片转化为分辨率更高的图像，再根据二维图像生成样品的三维图像。
在包括三位新科诺奖得主在内的科研人员的不懈努力下，冷冻电子显微镜技术有了极大的发展，已经成为可以媲美X射线衍射的研究生物分子结构的重要手段。相信在未来，这一技术会帮助我们更好地认识生命的奥秘。
主要参考资料：
Xiao-chen Bai, Greg McMullan, Sjors H.W Scheres, “How cryo-EM is revolutionizing structural biology”, Trends in Biomedical Sciences, 2015, 40, 49
Eva Nogales, Sjors H.W. Scheres, “Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity”, Molecular Cell, 2015, 58, 677
“The Nobel Prize in Physics 2017 – Popular Information: They captured life in atomic detail”.https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/popular.html
“The Nobel Prize in Physics 2017 – Scientific Background: The development of cryo-electron microscopy“，https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/advanced.html