很多人认识错误，PacBio三代测序最大的死穴是：通量不足。如果通量不是限制因素，那么PacBio是目前最准确的测序方式：错误率可以无限接近罕见突变的发生率（即无法分辨是测序错误还是罕见突变）。因为三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错，而如果系统错误，这是不可纠正的。一图展现区别：
那么为何三代通量不足？技术瓶颈了，这要从三代测序原理说起。PacBio三代测序基本单位叫做SMRT Cell，它是这样的：
实际有效面积，接近成人的大拇指指甲，在这个面积上，均匀分布着15万个小孔。
测序时，当有一个DNA分子落入一个小孔内（0或多个DNA分子，则为无效孔），该小孔能生成有效数据（这里有一个有效小孔比率，Loading率，一般是1/3左右，即5W个小孔）。测序时，每合成（延伸）一个DNA残基时，会释放带荧光标记的磷酸残基。那么连续记录这数万个小孔的荧光信号，再通过机器学习算法，即可将波信号转化成碱基序列，甚至可以获得碱基修饰信息(碱基修饰会改变波的动力学特征)。这个过程里，对聚合酶有特殊要求：1. 速度慢 2.延伸性好 3.准确性高。
那么三代技术瓶颈，到底在哪里？
简单讲，SMRT Cell的密度不是技术瓶颈，而是激光光路和感光元件。目前做到的地步是，精确分出15万束激光，射进每个小孔，感光元件可以精确记录每个小孔每次合成时，单个磷酸残基上荧光信号。
目前提高三代的通量，有以下几个途径：
- 升级硬件。这个是最直接有效的，直接提升那几个硬件短板的规格。但是，这也是最不可能的。因为升级任何一个短板硬件，都需要整个测序仪的硬件、耗材回炉。以目前PacBio的财报来看，还未实现盈利。与Illumina相反，PacBio在硬件上的利润非常微薄。据业内人士估计，Illumina成本每台估计大约在6～10万美元(零售价直接加0)，PacBio的售价略高于Illumina，但成本高好几倍，那个激光光路和感光元件放那里。。。。
- 提高Loading率。这个主要难度在建库和上样的优化上。
- 提高聚合酶延伸性并保持准确率。这个是目前PacBio（其实背后是某重组酶巨头）主要努力方向。以每Cell 5W条序列记，那么如果平均达到10kb读长，则产出为 5 x 10^8，也就是500M数据。提高到15kb则有750M。
目前在P6C4试剂下，大约每SMRT Cell平均可以做到 600M～1G数据量，个别用户达到2G（这个是DNA抽提和建库优化相当好了）。
来源：知乎 www.zhihu.com
作者：Tang Boyun
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